細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染防控全攻略——從預(yù)防到處理的系統(tǒng)化指南  

一、支原體污染的危害與識(shí)別  

隱性威脅：支原體無(wú)細(xì)胞壁，可穿透0.22μm濾膜，常規(guī)抗生素（如青霉素）無(wú)效，常導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、形態(tài)異常（如“空泡化”）、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，甚至基因表達(dá)譜改變。  

快速檢測(cè)：  

熒光染色法：使用染色，支原體DNA在紫外光下呈“星點(diǎn)狀”熒光。  

PCR檢測(cè)：針對(duì)支原體16SrRNA基因設(shè)計(jì)引物（如通用引物），靈敏度達(dá)10CFU/mL，3-4小時(shí)出結(jié)果。  

培養(yǎng)法：將細(xì)胞上清接種于支原體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)14天，觀察“煎蛋狀”菌落或酸堿指示劑變色。  

二、預(yù)防措施：源頭阻斷污染  

操作規(guī)范：  

嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，穿戴無(wú)菌手套、口罩，避免說(shuō)話時(shí)飛沫污染。  

定期清潔生物安全柜、培養(yǎng)箱，使用75%酒精擦拭臺(tái)面，紫外線照射30分鐘。  

避免交叉污染：不同細(xì)胞系使用獨(dú)立培養(yǎng)瓶、移液器，禁止共用培養(yǎng)基或血清。  

材料篩選：  

選用支原體檢測(cè)合格的胎牛血清，避免使用來(lái)源不明的血清。  

培養(yǎng)基、胰蛋白酶等試劑需經(jīng)0.1μm濾膜過(guò)濾，或添加支原體抑制劑。  

環(huán)境監(jiān)控：  

定期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)表面、培養(yǎng)箱水盤(pán)中的支原體含量，建立污染檔案。  

三、污染處理：精準(zhǔn)清除策略  

早期污染處理：  

若檢測(cè)到支原體，立即丟棄污染細(xì)胞，消毒培養(yǎng)瓶、移液器、生物安全柜。  

對(duì)未污染細(xì)胞進(jìn)行“支原體清除培養(yǎng)”：添加支原體特異性抗生素，連續(xù)培養(yǎng)3-4代后再次檢測(cè)。  

頑固污染處理：  

使用“抗生素沖擊療法”：交替使用不同作用機(jī)制的抗生素（如四環(huán)素類(lèi)+大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)），避免耐藥性產(chǎn)生。  

結(jié)合物理方法：如高溫處理（56℃30分鐘）、紫外線照射、過(guò)濾除菌等。  

替代方案：  

若細(xì)胞珍貴且無(wú)法清除支原體，可考慮使用“支原體清除試劑盒”，或通過(guò)有限稀釋法篩選未污染細(xì)胞亞群。  

四、后續(xù)監(jiān)控與質(zhì)量保證  

定期檢測(cè)：即使處理成功，也需每月對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，持續(xù)3-6個(gè)月，確保無(wú)復(fù)發(fā)。  

記錄與追溯：建立細(xì)胞培養(yǎng)檔案，記錄操作人員、試劑批號(hào)、檢測(cè)結(jié)果等信息，便于問(wèn)題追溯。  

質(zhì)量認(rèn)證：對(duì)于科研或生產(chǎn)用細(xì)胞，建議通過(guò)第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行支原體檢測(cè)認(rèn)證，確保符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。  

五、特殊注意事項(xiàng)  

避免過(guò)度依賴(lài)抗生素：長(zhǎng)期使用抗生素可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，或掩蓋支原體污染癥狀。  

關(guān)注細(xì)胞狀態(tài)：支原體污染常伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、形態(tài)異常，需結(jié)合顯微鏡觀察與檢測(cè)結(jié)果綜合判斷。  

人員培訓(xùn)：定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行支原體污染防控培訓(xùn)，提高操作規(guī)范性與污染識(shí)別能力。